入门丨一文读懂高效液相色谱（HPLC）基本原理及体系构成

文 / 利刃君

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高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）是色谱法的一个紧张分支，使用范围十分广泛，对样品的实用性广，不受分析目标挥发性和热安定性的限定，几乎一切的化合物包含高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因此补偿了气相色谱法的不敷。在现在已知的天然化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80%则需用高效液相色谱来分析。HPLC具有分散效能高、分析速率快、检测敏捷度好、能分析和分散高沸点且不克不及气化的热不安定生理活性物质的特点，已成为化学、医学、产业、农学、商检和法检等学科范畴中紧张的分散分析武艺使用。

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基本原理

色谱法的分散原理是：溶于活动相(mobilephase)中的各组分颠末安稳相时，由于与安稳相(stationphase)产生作用(吸附、分派、排阻、亲和)的轻重、强弱不同，在安稳相中滞留时间不同，从而先后从安稳相中流出。又称为色层法、层析法。

高效液相色谱法以经典的液相色谱为基本，以液体为活动相，接纳高压输液体系，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的殽杂溶剂、缓冲液等活动相泵入装有颗粒极细的高效安稳相的色谱柱，在柱内各因素被分散后，进入检测器举行检测，从而完成对试样的分析。

图1.高效液相色谱仪分析流程

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体系构成

HPLC 体系寻常由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据纪录及处理安装等构成。此中输液泵、色谱柱、检测器是紧张部件。别的，还可依据必要设置梯度洗脱安装、在线脱气机、主动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，古代HPLC 仪另有微机控制体系，举行主动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC 仪还备有主动馏分搜集安装。

图2.高效液相色谱仪的体系构成

1.输液体系

输液泵是HPLC 体系中最紧张的部件之一。输液泵依照输入液恒定的要素分为恒压泵和恒流泵，泵的功能优劣直接影响到整个体系的质量和分析后果的可靠性。

输液泵按事情办法分为气动泵和机器泵两大类。机器泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。

表1.几种高压功能泵的功能比力

HPLC使用的输液泵应满意下列条件：

①流量安定，其RSD 应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关紧张；

②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min 范围内一连可调，制备型应能到达100 ml/min；③输入压力高，寻常应能到达150~300kg/cm2；

④液缸容积小；

⑤密封功能好，耐腐化。

（1）往复式柱塞泵

活塞向外挪动时，泵头出口单向阀关闭，同时活动相进入的入口单向阀掀开，溶液（活动相）抽入活塞缸。当柱塞推入缸体时，入口单向阀关闭，出口单向阀掀开，活动相被压出活塞缸，流向色谱柱。双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。其优点是不必使用消弭脉冲的阻尼器，制止了阻尼器的压力斲丧，但缺陷是装备本钱较高，流量调治也比单活塞泵繁复。往复式柱塞泵的特点是不受整个色谱体系中其他局部阻力稍有厘革的影响，一连需求恒定体积的活动相。

图3.单活塞往复式柱塞泵的布局（A）和双活塞往复式柱塞泵布局（a）及排液特性（b）

（2）隔膜型往复泵

隔膜型往复泵也是一种恒流泵，活塞与油交往，当活塞往复活动时，隔膜遭到油压的作用，对活动相局部产生"吸引"或"推压"，使活动相局部的单向阀吸液或排液，从而取得安定的液流。隔膜泵的活塞不直接与活动相交往，故不存在活塞密封垫磨损对活动相的沾染。隔膜泵的死体积小（约0.1mL），因此，改换活动相后均衡快，有利于梯度洗脱。但隔膜泵布局比力繁复，价格较贵。

图4.隔膜型往复泵布局表现图

（3）气动扩大泵

气动扩大泵是一种恒压泵。泵头通常由两局部构成--单向阀和密封圈-柱塞杆。单向阀寻常由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球构成，在压力的作用下宝石球分开阀座，活动相流过单向阀；反之，在反向力的作用下，宝石球回到阀座上，此时活动相不再流过单向阀。

2.脱气安装

活动相溶液屡屡因溶解有氧气或混入了氛围而构成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上显现尖利的杂音峰。吝啬泡徐徐会萃后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使活动相的流速变慢或显现流速不安定，致使基线升沉。气泡一旦进入色谱柱，消弭这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还约莫惹起某些样品的氧化或使溶液pH值产生厘革。

现在，液相色谱活动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。

超声波振荡脱气： 将配制好的活动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种办法比力笨重，又基本上能满意平常分析利用的要求，以是，现在仍广泛接纳。

惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而匀称地通入储液罐中的活动相中，氦气分子将别的气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所构成的吝啬泡对检测无影响。

真空脱气安装： 将活动相经过一段由多孔性构成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵事情时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。

图5.真空在线脱气安装表现图

3.梯度洗脱安装

HPLC 有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种办法。等度洗脱是在同一分析周期内活动相构成坚持恒定，合适于组分数目较少，实质不同不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内步骤控制活动相的构成，如溶剂的极性、离子强度和pH 值等，用于分析组分数目多、实质差别较大的繁复样品。接纳梯度洗脱可以延长分析时间，提高分散度，改良峰形，提高检测敏捷度，但是常常惹起基线漂移和低落重现性。两种溶剂构成的梯度洗脱可按随意水平殽杂，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和门路形梯度。线性梯度最常用，尤其合适于在反相柱上举行梯度洗脱。