从pKa到活动相pH的封建选择（二）：缓冲液

前方先容了pKa干系的基本看法和稀有典范化合物的数据[从pKa到活动相pH的封建选择（一）：基本看法和pKa的确定或猜测]，今天接着来先容缓冲液。

基本看法

缓冲液（Buffer）：指由一种共轭的质子给体和质子受体构成的可离子化合物的溶液，它可以在到场少数酸或碱时维持溶液pH安定的作用。常用缓冲液溶质的pKa数据如下：

缓冲液的作用主要有两个方面：

（1）缓冲分析物，使其坚持在所需的pH值处。由于在实践分析事情中，色谱柱上的样品格量十分少，因此仅必要很少的缓冲液就能为样品提供充足的缓冲。假如样品与活动相的pH值相差大，且进样量太大，发起在进样前先调治样品溶液至接近活动相pH值。

（2）缓冲色谱柱，使其坚持恒定的pH值。由于多量的缓冲活动相经过色谱柱，以是安稳相不休暴露在缓冲液中。随着如今商品化的硅胶基质色谱柱纯度的提高，硅胶上的酸性硅醇基团的含量也越来越低，因此所需的缓冲液也越来越少。下图是高纯、中等纯和低纯硅胶的柱子在添加0.1%和增长0.01%TFA时分析图谱比力：

缓冲才能（Buffer Capacity）：它取决于两个要素：

（1）缓冲液的浓度。下图就是醋酸盐在5 MM，10 mM，20 mM和40 mM浓度下的缓冲容量，可以看到它屡屡在它的pKa，即pH 4.75处展现最大的缓冲才能，并且随着浓度增长，缓冲才能也增长。

因此为了取得充足的缓冲才能，寻常必要得当浓度的缓冲液。保举的终极溶液中，关于酸性添加剂寻常在0.1% v/v支配，大概最少含有5-10 mM的缓冲液。寻常来说，关于大大多的使用，10-25 mM的添加剂以前充足，但是最好依据具体情况确定。

（2）溶液的pH和缓冲盐pKa的差值。不同的缓冲液寻常有不同的缓冲范围，寻常来说，在其pKa值上下浮动1个pH单位内使用时，缓冲液是最好效的；在pKa值上下浮动2个单位内时，也可以提供充足的缓冲。因此从上表中就可以取得缓冲液对应的缓冲范围。

天然溶剂存本人的pKa和pH的厘革

文献中缓冲盐的pH和pKa以及分析物的pKa数据很多是在水中测定，但是pH和pKa都市随着天然溶剂的到场而产生改动。寻常来说随着天然溶剂的到场，酸的pKa变大，而碱的pKa变小。固然有这些厘革，缓冲液的缓冲才能并不会由于天然溶剂的到场而产生厘革。因此在设置缓冲液的时分，剧烈发起在到场天然溶剂之前调治pH值至目标值，当到场有溶剂后，溶液pH会产生厘革，但是此时无需再调治。别的，为避免殽杂历程中缓冲盐产生析出，务必将天然相到场水相，而不是将水相到场天然相。

常用缓冲盐点评

磷酸盐：是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，由于它可以在低于220 nm的波长下使用。磷酸盐具有三个pKa值，可提供pH 1.1-3.1，6.2-8.2，11.3-13.3三个缓冲范围，。固然它使用广泛，但是也要注意它的溶解度成绩，避免高浓度条件下在HPLC泵大概色谱柱中析出。

醋酸盐：也是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一，可以在低于220 nm的波长下使用。它可以提供pH 3.8-5.8的缓冲范围，因此它恰好补偿了磷酸盐在pH 2.0-8.0之间的缺口。

因此磷酸盐和醋酸盐的共同使用可以满意通常用于硅胶基质色谱柱的整个pH范围。

三氟乙酸：0.1%的三氟乙酸能产生pH≈2的活动相，多年来它不休是低pH条件下LC-MS的首选添加剂，但是TFA可以克制电离，招致信号下降。TFA也可作为离子对试剂，广泛用于卵白和多肽类的分析。

甲酸：0.1%的甲酸能产生pH≈2.7的活动相，以前成为低pH条件下LC-MS的首选。

总结

本篇围绕缓冲液掀开，重点先容了缓冲液的实质和基本数据、天然相对缓冲液实质的改动，也对常用缓冲盐举行了点评，渴望有助于各位在开发大概优化HPLC办法时选择切合的缓冲液。

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参考文献

1. Stavros Kromidas, HPLC Made to Measure, 2006, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

2. L. R. Snyder, J. J. Kirland, Introduction to Modern Liquid Chromatography 3rd. 2010, John Wiley & Sons, Inc.

3. Eric V. Anslyn, Dennis A. Dougherty. Modern Physical Organic Chemistry, 2006, University Science Books

4. John Dolan, A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection, www.ace-hplc.com