卵白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

【实行目标】

（1）把握SDS-PAGE分散卵白质的原理。

（2）把握用SDS-PAGE检测卵白质的办法及利用历程。

【实行原理】

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是在聚丙烯酰胺凝胶体系中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。1967年，Shapiro等人起首发觉，假如在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中到场一定量的SDS，则卵白质分子的电泳迁徙率主要取决于卵白质的相对分子质量轻重。

SDS是1种阴离子型去垢剂，带负电荷。因此，卵白质在含有强复原剂的SDS溶液中与SDS分子结适时，可构成SDS-卵白质复合物。这种复合物由于团结多量带负电荷的SDS，好比卵白质穿上带负电的“外套”，使卵白质本身带有的电荷被遮掩，起到消弭各卵白质分子之间本身的电荷差别的作用，因此在电泳时，卵白质分子的迁徙速率则主要取决于卵白质分子轻重，从而到达分散目标卵白的目标。同时，SDS-PAGE可以测定卵白质的相对分子质量。当卵白质的相对分子质量在15000～200000时，样品的迁徙率与其相对分子质量的对数呈线性干系，切合以下方程式：

lg Mr＝－b×mR＋K

式中，Mr为卵白质的相对分子质量；

mR为相对迁徙率；

b为斜率；

K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。

因此，经过已知相对分子质量的卵白与未知卵白的迁徙率比力，就可以得出未知卵白的相对分子质量。

【实行质料、试剂及仪器】

1．实行质料

实行31取得的经不同时间诱导的大肠杆菌。

2．实行试剂

（1）30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺1g，溶于60mL水中，加热至37℃溶解，定容到100mL，用0.45μm滤膜过滤，室温避光保存。

（3）分散胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）。称取Tris36.3g，溶于200mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至8.8。

（4）浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）。称取Tris12.1g，溶于200mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至6.8。

（5）10％过硫酸铵溶液：过硫酸铵1g加蒸馏水水定容到10mL，4℃下可储存1周，但最好现配现用。

（6）四甲基乙二胺（TEMED）。

（7）10％（m/V）SDS溶液：称取10g SDS于100mL蒸馏水中，微热使其溶解。储存液保存于室温，用前微热，使SDS完全溶解。

（8）5×Tris-glycine电泳缓冲液：称取Tris15.1g，甘氨酸94g，10％SDS50mL，加蒸馏水定容至1000mL。

（9）1mol/L DTT溶液：20mL0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）中溶解3.09g二硫苏糖醇（dithiothreitol, DDT），过滤除菌后分装成1mL每份，－20℃储存。

（10）2×SDS凝胶上样缓冲液：100mmol/L Tris-HCl（pH6.8），200mmol/L DTT（不含DTT的凝胶加样缓冲液800μL＋1mol/L DTT200μL。DTT现用现加。），4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油。

（11）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.25g，溶于90mL蒸馏水中，加甲醇90mL，再到场冰乙酸10mL，搅拌使之富裕溶解，必要时滤去颗粒状物质。

（12）脱色液：甲醇/冰乙酸/水（V∶V∶V＝3∶1∶6）。

（13）卵白质分子轻重标准参照物。

3．实行仪器

SDS-PAGE安装（每4人1套）

微量移液器（每2人1套）

高速离心机（每4人1台）

恒温摇床（全班1台）

－20℃冰箱（全班1台）

恒温水浴锅（每4人1台）

高压灭菌锅（全班1台）

电子天平（每8人1台）

1．5mL离心管（多少）

种种规格吸头（多少）

【实行步调】

1．SDS—聚丙烯酰胺凝胶的灌制

（1）根听分析书安装玻璃板。

（2）按表14.1所示配制10％分散胶溶液。

表14.1　SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳10％分散胶溶液配制表

（3敏捷在两玻璃板的间隙中灌注10％分散胶溶液，留出灌浓缩胶 所需空间（梳子齿长＋1cm），覆一层重蒸水（掩盖水层可避免因氧气分散进入凝胶而克制聚合反响），将凝胶垂直放于室温下，约莫20～40min后胶即聚合。

（4）倒出掩盖水层，用去离子水洗濯凝胶顶部数次以撤除未聚合的丙烯酰胺后，尽约莫排去凝胶上的液体，最初用滤纸条吸净残留液体。

（5）按下表所示配制5％浓缩胶（本实行配制2～3mL即可）。

表14.2　SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳5％浓缩胶溶液配制表

（5）由于到场TEMED后浓缩胶立刻开头聚合，故应在已聚合的分散胶上直接灌注浓缩胶，然后立刻在浓缩胶中插进干净的梳子，此时应警惕制止混入气泡，再到场浓缩胶以充溢梳子之间的清闲，待浓缩胶凝结（约30min）后，拔除梳子。用去离子水洗濯梳子数次以撤除未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸条吸干残留液体。

2．样品的制备及电泳

（1）将1.5mL细菌培养液经10000r/min离心2min，搜集菌体，存于－20℃冰箱中备用。将储存的菌沉淀样品＋5μL蒸馏水＋5μL2×SDS凝胶上样缓冲液在1个离心管中殽杂，100℃加热5min后，取出冷却至室温，12000r/min离心1min，取上清液。

（2）装好电泳体系，到场电泳缓冲液，上样8μL。

（3）将电泳安装与电源毗连，在凝胶上加8V/cm电压，待染料前沿进入分散胶后将电压提高到15V/cm持续电泳，直至溴酚蓝到达分散胶的底部。电泳历程约需80～150min。

（4）卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色留宿。到场脱色液，置于80r/min脱色摇床上，每20min改换1次脱色液至完全脱净。

（5）将脱色后的凝胶照相或干枯，也可用塑料袋密封在20％甘油水溶液中长时保存。

【典范实行后果分析】

抱负实行后果（见图14.2，泳道3，4）含有外源基因的重组质粒的菌株经IPTG诱导后表达出目标卵白片断。而不含重组质粒的菌株则不表达该卵白片断。

图14.2　大肠杆菌外源基因表达卵白的SDS-PAGE后果

1：卵白质分子轻重标准参照物；2～3：表达卵白样品；4：空缺比力

【实行注意事项】

（1）实行组与比力组所加总卵白含量要相称。

（2）为到达较好的凝胶聚合后果，缓冲液的pH值要准确，10％AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可愈加。

（3）未聚合的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性，可经过皮肤和呼吸道吸取，应注意防护。

（4）在“实行步调”1中（2）、（4）配制溶液时，一旦到场TEMED，胶立刻开头聚合，故应立刻快速旋动殽杂物并进入下步利用

（5）【参考文献】

［1］杨安钢等．生物化学与分子生物学实行武艺．北京：高等教导出书社，2008.

［2］梁宋平．生物化学与分子生物学实行教程．北京：高等教导出书社，2002.

［3］郭勇．古代生化武艺．广州：华南理工大学出书社，2001.

［4］Boyer RF. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Publishing Company Inc, 2000.

［5］Hanahan D, Jessee J, and Bloom FR. Plasmid transformation of E. coli and other bacteria. Methods in Enzymology, 1991, 204: 63～113.