薄层色谱的原理及使用要点

薄层色谱，或称薄层层析（thin-layer chromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为安稳相，以切合的溶剂为活动相，对殽杂样品举行分散、判定和定量的一种层析分散武艺。这是一种快速分散诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别好效的层析办法，从50年代提高起来至今，仍被广泛接纳。

一、基本原理

薄层层析是把支持物匀称涂布于支持板（常用玻璃板，也可用涤纶布等）上构成薄层，然后用相应的溶剂举行掀开。薄层层析可依据作为安稳相的支持物不同，分为薄层吸附层析（吸附剂）、薄层分派层析（纤维素）、薄层离子互换层析（离子互换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。寻常实行中使用较多的是以吸附剂为安稳相的薄层吸附层析。

吸附是外表的一个紧张实质。任何两个相都可以构成外表，吸附就是此中一个相的物质或溶解于此中的溶质在此外表上的茂密征象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的外表上，都约莫产生吸附征象。

物质分子之以是能在固体外表停留，这是由于固体外表的分子（离子或原子）和固体内里分子所受的吸引力不相称。在固体内里，分子之间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体外表的分子所受的力是不合错误称的，向内的一面遭到固体内里分子的作用力大，而外表层所受的作用力小，因此气体或溶质分子在活动中碰到固体外表时遭到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下去。吸附历程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一外表积上的分子和同一单位时间内分开此外表的分子之间可以创建动态均衡，称为吸附均衡。吸附层析历程就是不休地产生均衡与不屈衡、吸附与解吸的动态均衡历程。

比如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分派系数的不同，使殽杂物得以分散。当溶剂沿着吸附剂挪动时，带着样品中的各组分一同挪动，同时产生一连吸附与解吸作用以及反复分派作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附才能的差别，终极将殽杂物分散成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一同掀开，则可以依据这些已知化合物的Rf值（后方先容Rf值）对各斑点的组分举行判定，同时也可以进一步接纳某些办法加以定量。

薄层层析有很多优点：它坚持了利用便利、装备简便、显色容易等特点，同时掀开速率快，寻常仅需15～20分钟；殽杂物易分散，区分力寻常比以往的纸层析高10～100倍，它既实用于仅有0.01μg的样品分散，又能分散大于500mg的样品作制备用，并且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐化性显色剂。薄层层析的缺陷是对生物高分子的分散后果不甚抱负。

二、安稳相支持剂的选择和处理

在薄层层析时，对支持剂的选择主要思索两方面：一是支持剂的实质与实用范围；二是支持剂的颗粒轻重。寻常来说，所选吸附剂应具有最大的比外表积和充足的吸附才能，它对欲分散的不同物质应有不同的吸附才能，即有充足的区分力；所选吸附剂与溶剂及样品组分不会产生化学反响。吸附力的强弱纪律可归纳如下：吸附力与两相间界面张力的低落成恰比，某物质溶液中被吸附的水平与其在溶剂中的溶解度成反比。极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。本家化合物的吸附水平有一定的厘革朝向，比如，同系物极性渐减，而被非极性外表吸附的才能将递增。

1、支持物的实质与实用范围

薄层层析的支持剂较常用的是硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺及DEAE—纤维素。

（1）硅胶

硅胶是使用最广泛的一种极性吸附剂。它的主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，易制备成不同典范、孔径、外表积的多孔性硅胶，寻常以SiO2?xH2O通式表现。硅胶的吸附活性取决于含水量，吸附层析寻常接纳含水量为10%～12%的硅胶，含水量小于1%的活性最高，而大于20%时，吸附活性最低。用加热脱水法可使硅胶活化，低落吸附活性的硅胶能明显改良分散功能，增长样品的负载量。
硅胶实用于分散酸性和中性物质，碱性物质能与硅胶作用，因此如用中性溶剂掀开，碱性物质偶尔留在原点不动，大概斑点拖尾，而不克不及很好地分散。为了使某一类化合物取得满意的分散，可改动硅胶酸碱性。比如，可用稀酸或稀碱液（0.1～0.5mol/L）或一定pH值的缓冲溶液代替水制备酸性、碱性或某一pH值的薄层；也可在硅胶中到场氧化铝(碱性)制成薄层；或在掀开剂中到场少数的酸或碱举行展层。

使用硅胶和硅藻土时，通常要先到场粘合剂再在支持板上涂布。常用的粘合剂为煅石膏和淀粉，在硅胶、氧化铝和硅藻土中分散到场5%～20%石膏后，称为硅胶G、氧化铝G和硅藻土G。用煅石膏为粘合剂的薄层易从玻璃板上寥落，但具有耐腐化性试剂的优点。加淀粉制成的薄层，机器功能较好，但不宜用腐化性强的试剂。

（2）氧化铝

氧化铝为微碱性吸附剂，实用于亲脂性物质的分散制备，氧化铝具有较高的吸附容量，价格便宜，分散后果好，因此使用也较广泛。
在使用氧化铝作吸附层析时，要注意选择得当活性及得当酸碱度的产物。氧化铝通常可按制备办法不同而分为碱性、中性和酸性三种。碱性氧化铝可使用于碳氢化合物的分散；中性氧化铝实用于醛、酮、醌、某些苷类及酸碱溶液中不安定的酯、内酯等化合物的分散；酸性氧化铝实用于天然及构成的酸性色素以及醛、酸的分散。

（3）聚酰胺

聚酰胺由己二酸与己二胺聚合而成，也可用己内酰胺聚合而成，因它们都含有多量酰胺基团，故统称聚酰胺。

聚酰胺薄膜层析是1966年后提高起来的一种薄层层析办法，用此办法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸及DABTH-氨基酸时，具有敏捷度高、区分力强、展层敏捷和利用笨重等优点。现在由国产质料制成的聚酰胺薄膜功能精良、后果满意，已用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、构成染料；磺胺、抗菌素、环酮、杀虫剂及维生素B等16类化合物的分析。

（4）硅藻土和纤维素

它们是中性支持剂，需在吸附水、缓冲溶液或甲酰胺等之后，才干用于薄层层析。

2、支持剂的颗粒轻重

用作薄层层析安稳相的支持剂颗粒，要求轻重得当、匀称。颗粒过大，掀开时溶剂推进速率太快，分散后果不佳；颗粒太小，掀开太慢，斑点拖尾不会合，分散后果也差。颗粒轻重安稳在一定范围内并且薄层厚度匀称一律时，每次得出的Rf值即可坚持恒定。无机类支持剂的颗粒以150～200目（直径为0.07～0.1mm）、薄层厚度为0.25～1mm较切合。天然吸附剂如纤维素等的颗粒为70～140目（直径0.1～0.2mm）、薄层厚度为1～2mm最得当。

三、薄层板制造
薄层板制造简称制板，是指作为安稳相的支持剂被匀称地涂布在玻板上，构成一薄层。所用的玻板要求外表平滑、干净。玻板的轻重按必要选定，常用的规格为6cm×20cm、20cm×20cm及2.5cm×7.5cm。

1、软板制造

软板也称干板，是不加粘合剂，将支持剂干粉直接匀称地铺在玻板上制成的。这种薄层板制造简便，掀开快，但极易吹散。其具体制造办法如下：

（1）选用直径约为0.5cm的玻璃管一根，依据薄层的厚度（寻常为0.4～1mm）在其两头绕胶布数圈。

（2）将支持物干粉倒在玻板上，安稳玻板一端以防玻璃推进时挪动。

（3）将玻璃管压在玻板上，将支持剂干粉由一端推向另一端即成薄层。

2、硬板制造

硬板或称湿板，是将支持剂加粘合剂和水或其他液体后，匀称地铺在玻璃板上，再经烘干而成的薄层板。制造办法可用专门的薄层制板器，也可用手工，均能取得满意的后果。底下先容三种手工涂布制板的办法：

（1）玻棒涂布

将支持剂用水或得当溶剂调成胶浆，倒在玻板上，然后依软板制造相反办法，用玻棒在玻板上将支持剂由一端向另一端推进，即成薄层。

（2）玻片涂布

在玻板两旁安排两块稍厚的玻板，把支持剂胶浆倒在正中的玻板上，然后用另一块玻片的边沿将胶浆刮向另一端，即成一定厚度的薄层。干枯后用刀刮去薄板两侧的支持剂。改换玻板两旁不同厚度的玻片，即可调治薄层的厚度。

（3）倾斜涂布

将支持剂胶浆倒在玻片上，然后将玻板倾斜，使胶浆匀称涂布于玻板上。

上述任何一种办法将支持剂匀称涂布于玻板上后，静置半晌，待薄层外表无水渍后，置烘箱中，让温度升到100℃，持续1小时。关闭电源，待温度降至接近室温时，取出薄层板，放入干枯器备用。此一步调称为活化。

四、点样

点样是将经处理后的样品点加在薄层的特定部位，这是一项必要十分仔细的利用步调，点样的优劣会直接影响分散后果。点样可用玻璃毛细管，如作定量测定，应使用微量移液管或微量注射器，市售血球计数管经加工磨尖头部并标定体积后使用也甚抱负。点样的地点，抬升掀开法寻常点样在离薄层下端4～5cm处，下行掀开法在离上端6～8cm处。如作双相纸层析分散，点样处应位于距薄层右侧边5cm与距底边5cm直线的交点。

薄层层析点样办法应注意以下几点：

（1）样品最好器具挥发性的天然溶剂（如乙醇、氯仿等）溶解，不使用水溶液，因水分子与吸附剂的互相作用力较弱，当它占据了吸附剂外表上的活性地点时，就使吸附剂的活性低落，而使斑点分散。

（2）点样量不宜太多，不然会低落Rf值，寻常为几到几十μg，体积为1～20μg。

（3）原点直径要控制在2mm以内。欲达此目标，就须分次点样，边点样，边用冷、热风瓜代吹干。

（4）薄层板在氛围中不克不及安排太久，不然会因吸潮低落活性。

五、展层

1、掀开剂的选择

选择掀开剂须视被分散物的极性及支持剂的实质而定。对初选掀开剂切合与否的评价，要依据其分散好效因素的后果来确定。假如不切合，还需举行极性调停，直抵到达对好效因素的完全分散为止。

假如薄层层析所用的支持剂是吸附剂，在同一吸附剂上，不同化合物的吸附实质有如下纪律：①饱和碳氢化合物不易被吸附；②不饱和碳氢化合物易被吸附，分子中双键愈多，则吸附得愈严密；③当碳氢化合物被一个功效基代替后，吸附性增大。吸附性较大的化合物，寻常需用极性较大的溶剂才干推进它。

选择掀开剂的另一个依据是溶剂的极性轻重。寻常而论，在同一种支持剂上，凡溶剂的极性愈大，则对同一实质的化合物的洗脱才能也愈大，即在薄层上能把此化合物推进得愈远，Rf值也愈大。假如用一种溶剂去掀开某一因素，当发觉它的Rf值太小时，可思索换用一种极性较大的溶剂，或在原本的溶剂中到场一定量极性较大的溶剂举行层析。溶剂极性轻重的序次是：

石油醚<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水。

2、展层

展层安装品种较多，依据展层办法基本上可分抬升、下行、一连及水平式四种。不加粘合剂的薄层只能作近水平式（板与水平成10度～20度角）的抬升或下行掀开。不管何种展层办法，展层容器必需关闭，并事前要使掀开剂蒸气到达饱和。容器的体积轻紧张视薄层板的面积而定，由于大容器要到达溶剂蒸气饱和所需的时间比小的长。依据实行证实，在不饱和的展层安装中，由于殽杂掀开剂内含有几种挥发性试剂，致使薄层板边沿与正中的试剂比例不同，因此样品在边沿和正中展层的距离也不同，这种征象称为边沿效应，严峻时会影响分散后果。

薄层层析时为了取得更好的分散后果，可接纳双向展层和分次展层。分次展层是先用一种溶剂掀开至一定距离后，将薄层板取出，待溶剂挥发后再按同一朝向用第二种溶剂掀开。

六、显色和定量

薄层板掀开完成后，从掀开安装中取出，于室温或烘箱中干枯，然后依据被分散物质的品种和实质，选用相应的显色剂喷雾显色，或用紫外灯检测被分散的物质斑点，丈量和盘算各斑点的Rf值。经过薄层层析被分散的种种溶质组分在滤纸上挪动的速率通常用Rf表现：

Rf＝组分挪动的距离／溶剂前沿挪动的距离＝原点至组分斑点中央的距离／原点至溶剂前沿的距离。

在薄层、溶剂、温度等各项实行条件恒定的情况下，各物质的Rf值是安定的，它不随溶剂挪动距离的改动而厘革。Rf与分派系数K的干系：

Rf＝1/(1+αK)

α是由薄层实质决定的一个常数。由此可见，K值愈大，溶质分派于安稳相的趋向愈大，而Rf值愈小；反之，K值愈小，则分派于活动相的趋向愈大，Rf值是定性分析的紧张目标。

在样品所含溶质较多或某些组分在单相薄层层析中的Rf比力接近，不易分明分散时，可接纳双相薄层层析法。该法是将滤纸在某一特别的溶剂体系中按一个朝向展层今后，即予以干枯，再转向90度，在另一溶剂体系中举行展层，待溶剂抵达所要求的距离后，取出薄层，干枯显色，从而取得双相层析谱。使用这种办法，假如溶质在第一种溶剂中不克不及完全分开，而颠末第二种溶剂的层析能得以完全分开，大大地提高了分散后果。

由于薄层层析在分析定量时需注意以下几点：

（1）在喷雾显色时，不加粘合剂的薄层要警惕利用，以免吹散吸附剂。

（2）薄层层析还可以用强腐化性显色剂，如硫酸、硝酸、铬酸或其他殽杂溶液。这些显色剂几乎可以使一切的天然化合物变化为碳，假如支持剂是无机吸附剂，薄层板经此类显色剂喷雾后，被分散的天然物斑点即体现玄色。此类显色剂不实用于定量测定或制备用的薄层上。

（3）假如样品斑点本身在紫外光下不显荧光，可接纳荧光薄层检测法，即在吸附剂中到场荧光物质，或在制备好的薄层上喷雾荧光物质，制成荧光薄层。如此在紫外光下薄层本肢体现荧光，而样品斑点不显荧光。吸附剂中到场的荧光物质常用的有1.5％硅酸锌镉粉，或在薄层上喷雾0.04%荧光素钠、0.5%硫酸奎宁醇溶液或1%磺基水杨酸的丙酮溶液。

（4）由于薄层边沿含水量不一律，薄层的厚度、溶剂掀开距离的增大，均会影响Rf值，因此在判定样品的某一因素时，使用已知标准样刁难照。

（5）定量时，可对斑点作光密度测定，也可将一个斑点显色，而将与其相反Rf值的另一未显色斑点从薄层板上连同吸附剂一同刮下，然后用得当的溶剂将被分散的物质从吸附剂上洗脱下去，举行定量测定。

七、薄层层析法的近代提高

薄层层析法由于其本身所具有的很多优点，几十年来，在殽杂物的分散、定性及定量分析中的使用相当广泛，并渐渐代替了纸层析分散武艺。为了克制薄层层析法存在的某些不敷，取得更好效的分散后果，在薄层制备、掀开办法、分析判定伎俩以及相配套的仪器装备等方面比年来举行了很多改造，此中最基本的是支持剂的改良。以一种直径更小的支持剂颗粒交换常规的支持剂剂型所制备的薄层，比常规的薄层具有所需样品少、掀开速率快、距离短、区分力高等优点；并且此种新型的薄层具有较好的光学特性，更有利于对分散斑点举行光密度扫描。为了区别于常规的薄层层析分析法，通常将此种新办法称为高效薄层层析法（high performance thin-layer chromatography，HPTLC），也称古代薄层层析法（modern TLC）。

在举行HPTLC时，为了确保恒定的吸附剂活性和薄层板的相对湿度，预制板可用安稳相浸渍剂加以处理。经处理后的薄层板寻常不再受外界湿度的影响。安稳相浸渍剂分两类：①亲水性安稳相，大多用甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇和不同相对分子质量的聚乙二醇或不同品种的盐溶液浸渍；②亲脂性安稳相，寻常作反向层析用，大多用液体白腊、十一烷、十四烷、矿物油、硅酮油或乙基油酸盐等浸渍。也有使用与浸渍剂构成络合物或加成物得以分散的，如经三硝基苯或苦味酸浸渍的，可使用络合反响分散多环化合物。用NaHSO2浸渍，可与含有羰基化合物天生加成物而得以分散。