限定性内切酶——“分子手术刀”
限定酶的生物学功效源于反抗入侵细胞的外源DNA。细菌的限定-修饰体系使细菌本身的DNA碱基被甲基化修饰，从而不被本身的限定性内切酶识别切割。
限定性内切酶的提高
上世纪60年代初Werner Arber提出一种假想：有一种酶，可以堵截病毒的DNA来限定病毒增殖。
Kent Wilcox和Hamilton Smith发觉了第一种II型限定性内切酶Hind II，使得限定性内切酶取得富裕使用，Hind II可以精准“处决”DNA[1]，同时他们还发觉了甲基化酶可以经过甲基化修饰，保护细菌原有DNA免受Hind II的打击。
Kathleen Danna和Daniel Nathans经过研讨流感嗜血杆菌限定酶对SV40 DNA的特异性切割[2]，取得限定性内切酶图谱。
Daniel Nathans、Hamilton Smith和Werner Arber依靠在限定酶范畴创始性的研讨，协同取得1978诺贝尔生理学或医学奖。
停止现在，封建家已从原核生物中分散出多种限定酶，限定酶已成为基因工程中紧张的“手术刀”，并且以前商品化，在基因工程中广泛使用。
限定性内切酶的分类
依据限定酶的亚基构成、识别位点、酶切地点、辅因子、作用办法等要素，可将限定酶分为三品种型，分散是I型、II型、III型。
表 1 限定性内切酶分类表
I型和III型限定性内切酶因未能产生特定的切割片断，因此不具有实用代价，Ⅱ型限定性内切酶已被广泛使用于DNA分子克隆和序列分析，这是由于它们水解DNA不必要ATP，且也不以甲基化或其他办法修饰DNA，最紧张的是它们在识别序列内或四周切割双链DNA。
Ⅱ型限定性内切酶的切割序列常常是4-6 bp回文布局，这种酶有两种切割办法，一种是交织切割，构成粘性末了，另一种是在同一地点上切割双链，产平生末了。
II 型限定酶又可进一步细分为 IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等小种别，此中，IIS型限定酶可以在离它的不合错误称识别位点一侧卑劣的特定距离处切割DNA双链，这是由于此类限定性内切酶的识别序列和催化地区被一个毗连多肽分开；
IIS型限定酶的一个突出特点是对切割位点的序列没有要求，也就是可以识别序列外的随意核苷酸序列（稀有IIS酶切位点如图1所示）[3]。依据这一特性，在mRNA体表面成历程中，Poly（A）尾巴可以经过质粒DNA模板限定切割和转录取得，这一种办法可以在mRNA产物中到场特定命目标Poly（A）。
IIS型限定酶克隆的上风：
· 单一管中举行克隆：由于毗连产物中酶切位点散失，以是酶切和毗连可以在同一反响管中举行。
· 无痕克隆：不会引入多余序列。
· 同时组装多个片断：使用准确的互补末了组合可以同时组装多个片断。
图1. 稀有IIS限定酶酶切位点
限定性星号活性
星号活性( star activity ) : 是同一类限定性内切酶在某些反响条件厘革时，酶切割位点的专注性产生改动，比如酶浓度过高、反响液离子强度过低、pH改动等。
大大多星号活性是可以控制的，做酶切反响时寻常不需思索这方面的要素，只需在正常条件下，使用随酶提供Buffer，酶就不会显现星号活性。
影响限定性内切酶活性的要素
· DNA纯度：DNA中的杂质如卵白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都市影响酶的活性，寻常经过纯化DNA、加大酶的用量、延伸保温时间和扩展反响体系来改良。
· DNA甲基化水平：大肠杆菌寻常有dam和dcm两种甲基化酶修饰质粒，基因工程中必需使用甲基化酶失活渐变的菌株。
· 温度：不同限定性内切酶的最适反响温度不同。大大多是37?C，少数要求40-65?C。
· 缓冲液：缓冲液是影响限定酶活性的紧张要素，商品化的限定酶寻常都带有自用缓冲液。
【参考文献】
[1] KELLY T J, JR., SMITH H O. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. II [J]. J Mol Biol, 1970, 51(2): 393-409.
[2] DANNA K, NATHANS D. Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1971, 68(12): 2913-7.
[3] ENGLER C, KANDZIA R, MARILLONNET S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability [J]. PLoS One, 2008, 3(11): e3647.
