荧光显微镜

荧光显微镜

荧光显微镜简介：

荧光显微镜是光学显微镜的一种特别情势。 它使用荧光染料被一定波长的光引发后发光的才能。 感兴致的卵白质可以经过抗体染色或用荧光卵白标志用这种荧光染料举行标志。 它允许确定单个分子品种的分布、其数目及其在细胞内的定位。 别的，可以举行共定位和互相作用研讨，使用可逆团结染料察看离子浓度，比如 察看到 Ca2+ 和 fura-2，以及内吞作用和胞吐作用等细胞历程。 今天，乃至可以借助荧光显微镜对亚区分率粒子举行成像。

斯托克斯频移

荧光的一个紧张特性是斯托克斯频移。它形貌了引发光子和发射光子的能级差别。荧光染料发射的光子比引发光子具有更大的波长。这是由于在荧光染料被引发之后但在其发射光子之前向周围情况开释能量。由此产生的波长偏移使得区分引发光和发射光成为约莫。能量的吸取和发射可以看作是分子品种的特定特性。

荧光显微镜

荧光显微镜（正置或倒置）相似于平凡光学显微镜，不同之处在于照明由激光作为单色光或亮堂且强壮的光源（如汞蒸汽或氙弧灯）提供。别的，它还包含一个引发滤光片和一个发射滤光片。引发滤光片仅传输可以用其特定染料引发样品的光。样品发射的光在抵达检测器之前必需经过发射滤光片。发射滤光片仅对具有不同波长的光是半纯透的，比如样品发射的光。

1. 荧光显微镜的光通路

比年来，LED（发光二极管）也被用作荧光显微镜的光源。 LED 发射的光的波长取决于用于消费的质料。 但是，在大大多情况下都必要引发滤光片，由于 LED 通常会在相当宽的波长范围内发光。

大大多荧光显微镜是落射荧光显微镜。 照明器和物镜位于样品的同一侧，光源不会穿过样品。 除了引发和发射滤光片外，这种荧光显微镜还必要一个分色镜。 分色镜允许特定波长的光经过，而其他波长的光被反射。 滤光片和分色镜通常一同插进滤光片立方体中。

2. 滤波器原理

引发光经过引发滤光片并被引导至分色镜。这会将经过物镜的光反射到样品上。样品中的荧光染料被引发并发射光子。该发射光经过物镜前往到分色镜。发射的光具有得当的波长并且可以经过。被试样反射的引发光不克不及通太过色镜，会被挡住。假如引发光可以经过二向色镜，它会在抵达发射滤光片时被拦截。可以用检测器丈量经过发射滤光片的光。

荧光显微镜中使用了不同典范的滤光片。可以区分带通、长通和短通滤波器。带通滤光片传输一个波长带，而波长更大或更小的光将被拦截。长通和短通滤波器是边沿滤波器。长通滤光片传输长波长的光。波长高于某个停止值的光将无法经过。相反，短通滤光片传输短波长并拦截长波长。

不同的荧光显微镜中武艺

荧光显微镜被广泛使用并提供了很好的特异性。种种武艺可以处理不同的成绩，乃至可以绕过 Ernst Abbe 形貌的衍射极限。

分子品种的定位可以经过细胞器的共染色来确定，比如细胞器。细胞骨架或细胞膜。共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 可以在没有来自焦平面外部的信号的情况下察看样本中的地区，并允许举行光学切片。全内反射 (TIRF) 显微镜是一种允许察看接近细胞外表的薄地区的武艺。渐逝场引发该地区的荧光染料。

一种察看分子品种动力学的武艺是光漂白后的荧光规复 (FRAP)。限定地区中的荧光染料被光漂白，并且可以丈量未漂白分子分散到该地区中的情况。可以使用荧光能量转移 (FRET) 显微镜举行互相作用研讨。引发的供体生色团可以将能量转移到受体荧光染料并引发它。这仅有在两者十分严密地团结在一同时才有约莫。假如这些染料与不同的卵白质偶联，它们仅有在卵白质互相作用时才干转达能量并发射荧光。

允许亚区分率图像的武艺是受引发射耗尽 (STED) 显微镜、基态耗尽 (GSD) 显微镜、单分子和基态耗尽显微镜，然后是单个分子前往 (GSDIM)，以及光激活定位显微镜 (PALM) 和随机光学重修显微镜（STORM）。用于这些武艺的亚区分率显微镜也被称为纳米显微镜，由于它们在纳米标准上剖析图像。

5.Pukinje细胞，小鼠小脑皮质的三重标志旁矢状切面。 赤色：anti-calbindin-D28k/Cy3，绿色：anti-GFAP/Cy5，蓝色：Hoechst 33258